فلمینگ تحصیلات خود را در مدرسه پزشکی بیمارستان سنت مری لندن به پایان رساند و پس از آن به تحقیق در زمینه ایمنی‌شناسی و باکتری‌شناسی پرداخت. در خلال جنگ جهانی اول، او به عنوان پزشک نظامی خدمت کرد و متوجه شد که مواد ضدعفونی‌کننده بیشتر از اینکه میکروب‌ها را از بین ببرند، به سلول‌های بدن آسیب می‌زنند. این تجربه او را به سمت کشف پنی‌سیلین هدایت کرد.
کشف پنی‌سیلین در سال ۱۹۲۸ به طور تصادفی رخ داد، زمانی که فلمینگ متوجه شد کپکی که به طور تصادفی در یکی از ظروف کشت باکتری رشد کرده بود، باکتری‌ها را از بین می‌برد. این کشف انقلابی در علم پزشکی ایجاد کرد و فلمینگ به همراه هاوارد فلوری و ارنست چین در سال ۱۹۴۵ جایزه نوبل فیزیولوژی و پزشکی را دریافت کرد.
فلمینگ به پاس دستاوردهای علمی‌اش در سال ۱۹۴۴ به نشان شوالیه مفتخر شد و در سال ۱۹۹۹ به عنوان یکی از ۱۰۰ شخصیت برجسته قرن بیستم توسط مجله تایم انتخاب شد.